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轉基因動物的檢測

發表時間:2019-01-29 15:59
來源:《實驗動物管理與實用技術手冊》 作者:徐國景 易工城 唐利軍 孔利佳
摘要:無論用哪一種方法制作轉基因動物,對獲得的動物都需要進行外源基因的整合和表達水平的檢測。在 GFP 等直觀的標記基因發明之前,轉基因動物的檢測主要依賴分子雜交技術。即使是在標記基因使用之后,分子檢測仍然是必不可缺的.

無論用哪一種方法制作轉基因動物,對獲得的動物都需要進行外源基因的整合和表達水平的檢測。在 GFP 等直觀的標記基因發明之前,轉基因動物的檢測主要依賴分子雜交技術。即使是在標記基因使用之后,分子檢測仍然是必不可缺的?;蚍肿訖z測的基本原理是使用只同目標基因的序列發生結合的探針進行分子雜交,從而探測出外源基因是否已經整合到動物的基因組中。這是初步的整合檢測。如果深一步的研究,要了解整合的位點和整合的拷貝,還要進行外源基因的定位和整合拷貝數的測定。接下來,對于經整合檢測已經確認的轉基因動物,還要進行表達檢測。因為并非所有的轉基因動物都能表達目的基因的產物,即使有表達,其表達的水平也不盡相同。根據目的基因表達產物的不同,檢測的方法也有多種。

( 一 ) 整合檢測

1. 采樣及提 DNA

用于提取 DNA 供分子檢測的動物組織,一般是新生幼仔的耳或尾組織,逐頭采樣,編好號,剪成小塊,置于液氮中,凍結。也可以采血 5O~80μl(小鼠) 放入 DNA 抽提液中。

提取 DNA: 組織樣在液氮中磨碎;取 loomg 放人有 1.2ml DNA 抽提液的小管中,50 ℃溫育18h,并伴有輕搖。

(1)DNA 提取液

100m mol/L NaCI

10m mol/L Tris · Cl,pH8.0

25m mol/L EDTA,pH8.0

0.5%(w/v)SDS

100μl蛋白酶 K( 臨用前加入 2Oμl/ml 貯存液)

不含蛋白酶 K 情況下,DNA 提取液于室溫可以長期保存。

(2) 用等體積的酚/氯仿/異戊醇 (25:24:1)抽提樣品,重復 2 次,水相為 DNA 溶液(操作過程中需緩慢輕柔)。

(3) 加 2 體積無水乙醇,輕混。

(4) 用 tip 挑出紊狀 DNA,并在 75% 乙醇中洗一次,空氣干燥 , 然后溶解于含 0.1μmol/ml無 DNA 酶的RNA酶TE中,使 DNA 終濃度約為 1mg/m1,4 ℃保存備用。

而對于希望能獲得非常好 Southern 結果的研究就需要下列 DNA 提取方案 :

1)100mg的碎組織樣放于1ml提取液中(0.5M EDTA,pH8.0,100μl蛋白酶 K,0.5%十二烷基磺酸鈉)。

2)50 ℃水浴 2Oh, 隔時輕輕轉動溶液。

3) 用等體積平衡酚緩和抽提3次,離心除酚及界面雜物(酚一般都處于下層)。

4) 將 DNA 液對 100 體積的溶液(5OmM Tris·cl,pH8.0,1OmM EDTA,1OmM NaCI) 透析換液多次,直到透析物 OD270 小于 0.050

5) 用終濃度為 100μg/ml 的無DNA 酶的 RNA 酶 37 ℃處理 3h。

6) 等體積酚氯仿混合液輕抽提2次。

7) 用TE充分透析樣品,4℃保存備用。

2.PCR 檢測

PCR 檢測的特點是快速、靈敏。不同的外源基因,根據 PCR 引物設計的原則,設計并合成一對或數對引物(以便對引物篩選)。先摸索循環反應的最佳條件之后,正式加樣進行 PCR擴增,電泳檢查,確定陽性的樣品。PCR 易出現假陽性,因此需要進一步驗證。

3. 斑點雜交 (Dot blot) 和 Southern 印跡雜交

對 PCR 擴增初選出來的陽性樣品,還應進一步通過分子雜交來驗證。當目的基因與內源基因組 DNA 元同源性時,可用斑點雜交。但如基因拷貝數少或嵌合體時,也會有假陰性。當目的基因與內源基因組 DNA 有較高的同源性時,最好用 Southern 印跡雜交。這是由于在絕大多數情況下原代轉基因動物所攜帶的外源基因以隨機方式整合在基因組中,常常會有首尾相連的現象。以 Southern blot 分析便可了解整合方式,從本質上與宿主的基因組同源區分開,而Dot bolt 無法做到這一點。

到目前為止,Southern 印跡雜交仍是公認的最可靠的分子檢測方法。進行 Southern 雜交時,底物中應包括未曾酶解的大分子 DNA 和至少兩種限制性內切核酸酶消化的 DNA 樣本,只有三種樣本都給出合理的結果,才能確認目標基因確實已整合到基因組中。

4. 外源基因的定位一一染色體原位雜交

對確認的轉基因動物,為了研究整合位點與表型性狀、表達量之間的關系,需通過染色體的原位雜交,確定外源基因整合的位點。

鄧輝南等人建立的轉基因動物染色體原位雜交技術操作如下。

(1) 染色體的制備。以無菌手術采轉基因動物耳靜脈血,放入盛有肝素(1000u/ml) 的到水瓶中,搖勻,4 ℃靜置,使紅細胞沉降。取上層血漿層 0.5ml 接種于含有 PHA、青霉素、鏈霉素和20%胎牛血清的 RPMⅠ1640 5ml中。37℃培養6h后,加100μg/ml5'Brdu,繼續培養 12h。細胞經洗滌后,重新懸浮在新鮮的含有2.5μg/m1 胸腺嘧啶的培養基中,37 ℃再培養 6h。收獲前知聞

加入秋水仙素 0.04μg/ml。按常規方法制備外周血淋巴細胞染色體玻片標本。置 4℃備用。

(2) 探針標記。對外源基因進行酶切,選取適當的片段(也可用全基因),將 Dig-11-dUTP用隨機引物法進行探針標記,也可用同位素標記制備探針。

(3) 變性與雜交。首先對染色體玻片標本進行預處理,每張玻片加 100μl RNA 酶 (100μg/ml),蓋上蓋玻片,置于潮濕皿中,37 ℃,1h;去除蓋玻片,用 2 × SSC 洗片 5 次 SSC:NaCl(3mol/L)+ 高溫滅菌檸檬酸鈉(pH7.0,0.3mol/L)的混合溶液。再用乙醇(70% 、80%、90%、100%)逐級脫水,空氣干燥。然后探針與染色體共變性雜交: 在每張玻片上加雜交液 (1ng/μl 標記探針,50% 甲酰胺,10% 硫酸葡萄糖,0.5mg/ml 硅魚精子 DNA,2 × SS)100μl,蓋上蓋玻片,72℃變性 lOmin,迅速置于碎冰上;將共變性的玻片置于潮濕皿中,42 ℃雜交16h。最后進行脫水處理: 雜交反應的玻片用 50% 甲酰胺,2 × SSC 洗滌 5 次,每次 5min。

(4) 基因定位。將洗滌過的雜交玻片標本在 PBS 中洗一次,去除多余的 PBS,但不使玻片完全干燥。在玻片上加 1Oμl膠體金標記的抗 Dig 抗體,蓋上蓋玻片,室溫下反應30min。用 PBS 洗滌一次,然后每次用 200ml 去離子水洗 5 次,以去除氯離子。在每張玻片上加新配制的銀增加試劑 100μ1,在潮濕皿中,室溫避光作用 3Omin。用去離子水洗滌數次以終止反應。

(5) 染色體 G- 顯帶。用熒光 -Giemsa 則法進行染色體顯帶 : 在玻片上加5μg/ml Hoechst33258,室溫避光作用 30min,2 × SSC 洗滌 3 次,紫外燈照射 6Omin,用去離子水洗滌就此 10%Giemsa 染色劑 (用 0.06mol/L PB,pH6.8 稀釋)染色10min;用去離子水洗去多余的染色劑,自然干燥后鏡檢。

(6) 鏡檢與分析。泊鏡下選擇染色體數目完整、帶型清楚的中期相進行分析。只計數與染色體接觸的銀顆粒。最后進行統計分析,確定外源基因的整合位點。

5. 外源基因整合拷貝數的測定

測定外源基因整合的拷貝數,對于轉基因動物整合機理和遺傳規律的研究,以及整合拷貝數與表型性狀表達關系的研究,具有重要意義。湖北省農科院動物胚胎工程及分子育種實驗 室所建立的技術操作如下。

(1) 探針制備及標記。酶切外源基因,取特異片段做探針,用隨機引物法進行同位素標記。

(2) 組織樣 DNA 提取。

(3) 標準及待測樣品系列制備。用 Dig-DNA 標記檢測盒中的 PBR326 標準 DNA(200μg/ml)稀釋成不同濃度的標準系列,所含 DNA 濃度從低到高依次為(pg/μl):0.1,0.5,1.0,10, 20,30,40,50,60,100;取標準 DNA, 待測樣品 DNA, 陰性對照非轉基因動物 DNA 各 3×6μl,置于 0.5ml的 EP 管中,將各管置于95~100℃水浴中變性 10min 后,迅速置于冰水中;變性之后,各管加 3×4μl SSC,3×6μl TE混合;將準備好的纖維素膜裝入加樣品,點樣,每個點樣孔加入 DNA 溶液 15μl,每個樣品重復 3 次;點樣后抽真空,取出纖維素膜80℃烘干 2h。

(4) 雜交。將預雜交液預雜交6h,加入同位素標記好的探針,于65 ℃搖床中雜交 24h;再用纖維素膜,先用洗膜液 1(2 × SSC,0.1SDS) 洗 2 次,每次 5mn;再用洗膜液 2(0.5 × SSC, 0.1%SDS) 在60℃下洗 2 次,每次15min;洗脫后的雜交膜晾干,按標記部位將各樣品點剪下,分別裝入標好號的液體閃爍記數杯中。

(5) 消化。纖維素膜裝好后立即向杯內各加入60%高氯酸(HC104)300μl,30% 過氧化氫(H2O2)600μl,異丙醇1滴,加蓋,置于7O~80℃的恒溫培養器中消化1~2h。

(6) 樣品放射性測量。利用FJ-2101G 型雙道液體閃光計數器進行。消化后的樣品加10ml閃爍液 (PP0 6g),二甲苯 670μl,Tritonx 100~300μl,置避光處暗適應 8~1Oh 以減少因化學發光而引起的計數誤差, 然后上機進行測量。

(7)拷貝數分析。按如下公式進行:

式中,N---每個細胞所含外源基因拷貝數;

    nc---待測樣品所含細胞數;

    Nc---液體閃爍計數度(CMP)

( 二 ) 表達檢測

1. 轉錄水平(RNA)的檢測

一般而言,轉基因動物轉錄水平的檢測不主張開腹取樣,對于一些在特異器官或組織表達基因,開腹取樣會嚴重影響動物的健康。而淺表組織表達檢測采樣是可行的。進行 RNA 水平上的檢驗 ,Northern blot 對同源性較小的外源基因是首選方法;而對于同源性較高的外源基因,轉錄水平的檢測可以參考用 RT-PCR 法。Northern 雜交的底物是RNA,與探針進行 RNA/DNA 雜交。底物可以是從不同組織提取的總 RNA,也可以是經過純化的總的 mRNA 。進行Northern 雜交時,需要在抑制RNA酶活性的條件下進行電泳分離和雜交,一般不需要將 RNA酶解成片段。如果 Northern雜交的結果是陽性,也可以反過來佐證已成功地獲得了轉基因動物。

2. 翻譯水平 ( 蛋白質 ) 的檢測

轉基因動物的最終目的是獲得表達產物,所以翻譯水平的檢測結果是轉基因動物構建是成功的關鍵指標。表達產物檢測就是檢查目標基因編碼的蛋白質,大致需要分四步進行。

第一步,要從表達基因的靶組織提取總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,觀察有無分子質量與目標產品相同的新蛋白質條帶出現。如果已知產品表達量很低,常規的電泳不易觀察到,還要用放射性同位素標記新合成的蛋白質,電泳后轉移到感光膜上觀察基因表達情況。

第二步,如果看到了分子質量與目標產品相同的新蛋白質條帶 , 就要對它進行定性研究,方法是進行 Western blot, 將凝膠上所有蛋白質條帶轉移到雜交膜上,用目標產品的特異揣 進行雜交。也可以用 EUSA 的方法來檢測,它的原理也是抗原/抗體親和性測定。

第三步,如果目標產品已被確定,要進一步對它的末端氨基酸排列進行測定,看一看是否與天然蛋白質相同 。

第四步,如果產品的生物活性決定著產品的價值,要對產品進行生物活性測定。產品生物活性測定,則要根據蛋白質的種類選擇不同的測定方法。


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